A Halo: Nightfall Jameson Locke, az egyik legtitkosabb katonai ügynökség, a Tengerészeti Hírszerző Iroda (ONI) legendás fejvadászának történetét meséli el. Csapatával egy terrorista sejt után nyomoz a távoli Sedra bolygó telepesei között, amikor váratlanul egy hatalmas erejű biológiai támadás történik a telepen.

Locke és emberei egy tekintélyes katonai múlttal bíró, azonban az ONI-t gyanúval kezelő helyi parancsnok, Randall Aiken segítségével vetik bele magukat az ellenség felkutatásába. Nyomozásuk közben egy ókori leletre bukkannak, mely létezésének ismeretében megkérdőjeleződik bennük küldetésük légjogosultsága, miközben az életüket egyre nagyobb veszély fenyegeti.